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農林牧漁-獸醫學:非洲豬瘟的實驗室診斷技術
本著接地氣的原則,筆者嘗試著對非洲豬瘟的實驗室診斷技術,主要是熒光定量PCR技術和酶聯免疫吸附技術,展開分析討論,供ASF防控參與者一同交流。商品化試劑盒常常做為技術的載體出現,這里不做任何廠家試劑盒的廣告,僅從技術角度分析討論。在討論診斷技術之前,筆者提出ASF商品化試劑盒的選擇原則。
1、試劑盒選擇原則
01、敏感性比特異性更重要
去年8月3日沈陽非洲豬瘟疫情確診之前,我國并不是ASF疫區,根除非洲豬瘟病毒的過程中,診斷技術敏感性與特異性不能兼顧的情況下,敏感性比特異性顯得更加重要。用ELISA方法檢測ASFV抗體時,間接ELISA較阻斷ELISA的敏感性有優勢。OIE官方建立的方法,也是間接ELISA(OIE Terrestrial Manual 2012; Chapter 2.8.1)。有條件的話,可以采用間接ELISA篩選,阻斷ELISA復核。
2、假陰性比假陽性危害更大
得到非洲豬瘟的實驗室檢測結果后,陽性結果必然一下子戳中神經,震撼不已,對于陽性結果必然會進行復核。倘若是假陽性,便是虛驚一場。反而陰性結果常常直接略過,不被重視,若此結果是假陰性,那后果將是災難性的。
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真實陽性 |
真實陰性 |
檢測陽性 |
√√√ |
× |
檢測陰性 |
××× |
√ |
3、經過驗證的商品化試劑盒才可信
qPCR和ELISA是非常成熟的技術,商品化試劑盒的方法建立難度不大,而用大量臨床樣品、田間樣品和標準品對商品化試劑盒驗證與質控的過程,能夠體現出嚴謹的科學態度。國內首發非洲豬瘟疫情之前并非疫區,無法收集到陽性樣品,自主研發的商品化試劑盒的驗證存在現實困難。不過日前農業部公布的兩批非瘟試劑盒應該經過了驗證,實驗室可以放心使用。重磅!肇慶大華農通過第二次非洲豬瘟現場快速檢測試劑評價
2、熒光定量PCR
筆者認為選擇經OIE參考室驗證的商品化試劑盒用于ASF監測排查,盡快掌握國內ASF疫情,快速處置,對ASF根除是有利的。部分商品化試劑盒在歐非等傳統ASF疫區普遍使用,產品成熟而可靠。
若采取統一“度量衡”,以便于全國檢測結果數據的橫向比對。采用OIE推薦的非洲豬瘟病毒擴增p72基因分型的通用型引物(p72-D/p72-U),開展監測排查具有現實可行性。導致檢測結果出現假陽性和假陰性結果的因素很多,假陽性的原因自查后會發現,而如何避免假陰性結果的出現,是在檢測工作開始之前需要認真考慮的事情。qPCR檢測結果的價值取決于所用試劑的質量,除了引物以外,還需要提取試劑、預混液、對照試劑等。
筆者在這里提出幾點建議:
1、提供有效的檢測樣品是前提
《非洲豬瘟現場排查手冊》對樣品的采集、包裝與運輸做出了詳細說明,推薦使用“三重包裝系統”,運送的樣品必須附有做夠的冷卻材料(如冰袋),以防變質。確保送達實驗室的待測樣品是有效的,是開展檢測工作的前提。實際基層采樣工作中,低溫保存和運輸是存在現實困難的。在這一方面OIE參考實驗室德國FLI實驗室(Friedrich-Loeffler-Institute)做了很好的嘗試,采用GenoTube拭子采樣管做為采樣工具,常溫運輸和保存送達實驗室,開展qPCR核酸檢測,ELISA和膠體金檢測卡抗體檢測。更欣喜的是FLI對非洲豬瘟的樣品采集進行了驗證。
2、建立更嚴謹而合理的檢測體系 設立內部陽性對照(IPC) 有效預防假陰性結果出現
國內獸醫實驗室qPCR檢測中會設立陰性對照和外部陽性對照,但卻很少設立內部陽性對照(IPC)。Xeno IPC其實就是與所有物種基因組無交叉的核酸序列,被檢測樣品結果陰性,Xeno IPC檢測結果陽性(Ct值預期范圍是已知),有效證明無qPCR抑制劑存在,從而降低了假陰性結果的風險,對ASF這類重大動物疫病監測具有重要的意義。美國獸醫實驗診斷協會(AAVLD)在實驗室指南中明確推薦Xeno IPC在qPCR檢測過程中使用。
3、選擇高品質的核酸提取試劑和預混液
PCR檢測結果的價值取決于所用試劑的質量。核酸提取試劑盒必須是通用型樣品制備試劑盒,可滿足實驗室對多種樣品類型檢測需求,并對全血、脾臟、淋巴結、扁桃體和環境樣品等進行過驗證。模塊化技術經過專門優化,能夠從最廣泛的樣品類型之中純化核酸,具有高簡便性、性能一致性并節省時間和成本,從而幫助提高實驗室的效率。預混液要求對酶進行優化,以幫助鑒定那些最重要的動物病原體靶標,嚴格開發的試劑穩定且一致,即使用于最具挑戰性的動物樣品,在PCR抑制劑存在的條件下也依然有效。簡單易用的預混液都能幫助獲得值得信賴的結果。
4、環境樣品的檢測結果反應生物安全防護措施是否得當
做好生物安全防護措施才能有效預防非洲豬瘟的傳入已成為共識,問題來了,如何證明生物安全防護措施是否得當?構建完善的生物安全監控網絡,有計劃的采集動物體和環境樣品進行qPCR檢測,通過客觀數據足以量化生物安全措施的防護程度。尤其是針對豬場交叉區域的出豬臺、賣豬車、無害化處理車、員工澡堂地面等區域環境樣品的檢測。
3、ELISA檢測技術
在《我國首例非洲豬瘟的確診》(王清華等)中指出,在非洲豬瘟確診的遼寧省沈陽市沈北區采集的2頭病死豬及同群30 頭臨床健康豬血清,“對32 份血清樣品的ASFV 特異性抗體檢測結果均為陰性。” 通常感染了強毒力ASFV的豬只不產生抗體,感染了低致病力或非致死性毒株的豬產生高水平的抗體。急性或最急性死亡,病死率幾乎100%是目前我國流行的非洲豬瘟疫情的顯著特點,感染豬只未產生ASFV抗體已經死亡,因此很多人認為在當前疫情的情況下,開展血清學抗體檢測是無意義的,在此筆者嘗試著推敲當前疫情下ASFV抗體檢測意義。
筆者認為ELISA抗體檢測存在以下意義:
1、急性死亡的病例中也可以檢出抗體
《OIE陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》強調:“在呈地方性流行或由低毒力毒株引起的初次爆發的地方,對于新暴發病的調查研究應包括應用ELISA檢測血清或組織提取物中的特異性抗體;血清學方法在輔助確定ASF暴發時的作用不可低估,因為在急性死亡的病例中也可以檢出抗體。”
2、及時發現新傳入毒株或弱毒株 全面揭示ASF疫情狀況
我國首例確診非洲豬瘟病毒株為格魯吉亞毒株(Georgia 2007),病死率100%,應該屬于強毒力毒株。但同時該毒株從東歐傳入俄羅斯,又傳入遠東地區傳入中國,相比較而已,弱毒力毒株具有一定的隱蔽性,更有利于其長距離的傳播。從這一點上來看,傳入我國的ASFV格魯吉亞毒株可能也具備一定的隱蔽性。另外,已經明確了23種基因型(Boshoof等,2007),報道的來自不同區域的毒株超過58株。其他基因型或毒株并不會靜候在國門之外,強弱毒株都有出入的風險存在。
3、及時發現非洲豬瘟病毒變異后引起的豬場感染
1921年非洲豬瘟在肯尼亞第一次報道,家豬的死亡率為100%(Montgomery,1921)。2010年從不同地區和宿主(家豬、疣豬、扁虱)上分離得到的11株非洲和歐洲ASFV分離株,毒力大小各不相同,在基因組水平也呈現顯著的遺傳差異(De Villlier等,2010)。我國養豬過程中疫苗免疫種類多大劑量,豬體內抗體種類多,存在其他疫病抗體與ASFV交叉反應,以及干擾素等非特異性免疫應答的可能性,這可能導致ASFV感染豬病程增長,甚至產生抗體。若ASF在國內出現大規模流行,也可能出現病毒馴化的情況。較qPCR的抗原檢測,ELISA抗體檢測能夠幫助豬場及時發現非洲豬瘟病毒變異后的感染。
4、及時發現隱性帶毒動物
家豬和野豬都是ASFV等天然宿主,其中有三種非洲野豬可以隱性帶毒,成為病毒儲存器,這三種野豬是疣豬(Phacochoerus aethiopicus)、大林豬(Hylochoerus meinertzhageni)和非洲野豬(Potamochoerus porcus)(De Tray,1957)。我國除了野豬,還有眾多的地方豬品種,很有可能存在眾多對來勢洶洶的ASFV不當回事,隱性帶毒的動物存在。這一問題如果不能及時發現,后患無窮。
綜上所述,我認為ASFV抗體檢測的意義在于:抗體陽性結果具有明確的診斷意義,抗體陰性結果不能說明任何問題,需正確看待。抗體檢測在當前會為我們揭示更全面的ASF疫情,在ASF根除過程中幫助我們及時發現疫情的變化。
目前進口的商品化ELISA抗體檢測試劑盒并不多,以下品牌的ELISA試劑盒都經歐盟非洲豬瘟參考實驗室(同時也是OIE和FAO非洲豬瘟參考實驗室)西班牙CISA-INIA實驗室驗證,可以查詢對應的驗證結果,可網上自行查詢選擇。
制造商 |
技術類型 |
包被抗原 |
立陶宛 LT Biotech |
間接ELISA |
p22 |
法國 IDVET |
間接ELISA |
重組蛋白 |
瑞典 SVANOVA |
間接ELISA |
p30 |
西班牙 INGENASA |
阻斷ELISA |
p72 |
CISA-INIA指出,在ASF呈地方流行的區域,確診可疑病例最好用標準的血清學試驗(ELISA),結合另一種血清學試驗(IFA)或抗原檢測試驗(FAT)。在有些國家,95%以上的陽性病例用IFA和FAT結合方法鑒定。IFA和FAT技術目前在國內獸醫實驗室普及度很低,建議多結合qPCR核酸檢測結果診斷。(資料來源:獸醫獸診斷試劑)
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